Продукти

Начинът, по който ефектите от едновременните мутации се комбинират, за да променят ензимната активност, не е лесно предвидим, тъй като тези ефекти не винаги са адитивни по линеен начин.Следователно, характеризирането на ефектите от едновременни мутации на аминокиселинни остатъци, които свързват субстрата, може да допринесе значително за разбирането на субстратната специфичност на ензимите.В бета-гликозидазата от Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) и двата остатъка Q39 и E451 взаимодействат със субстрата и това е от съществено значение за определяне на субстратната специфичност.Двойни мутанти на Sfbetagly (A451E39, S451E39 и S451N39) бяха получени чрез сайт-насочена мутагенеза, експресирани в бактерии и пречистени с помощта на афинитетна хроматография.Тези ензими се характеризират с помощта на р-нитрофенил бета-галактозид и р-нитрофенил бета-фукозид като субстрати.Съотношението k cat/Km за единични и двойни мутанти на Sfbetagly, съдържащи сайт-насочени мутации в позиции Q39 и E451, беше използвано, за да се демонстрира, че ефектът върху свободната енергия на ESdouble dagger (комплекс ензим-преходно състояние) на двойните мутации (Gdouble daggerxy) не е сумата от ефектите, произтичащи от единичните мутации (Gdouble daggerx и Gdouble daggery).Тази разлика в Gdouble dagger показва, че ефектите от единичните мутации частично се припокриват.Следователно този общ ефект се брои само веднъж в Gdouble daggerxy.Кристалографските данни за бета-гликозидазите разкриват наличието на бидентатна водородна връзка, включваща остатъци Q39 и E451 и същата хидроксилна група на субстрата.Следователно както термодинамичните, така и кристалографските данни предполагат, че остатъците Q39 и E451 упражняват взаимно влияние върху съответните им взаимодействия със субстрата.