Продукти

Нов високоефективен течен хроматографски анализ за гликозилтрансферази, базиран на дериватизация с антранилова киселина и флуоресцентно откриване.

Тестовете са разработени с помощта на уникалната химия за маркиране на 2-аминобензоена киселина (2AA; антранилова киселина, AA) за измерване на активността както на β1-4 галактозилтрансфераза (GalT-1), така и на α2-6 сиалилтрансфераза (ST-6) чрез високоефективна течност хроматография (HPLC) с флуоресцентно откриване (Anumula KR. 2006. Напредък в методите за флуоресцентна дериватизация за високоефективен течен хроматографски анализ на гликопротеинови въглехидрати. Anal Biochem. 350:1-23).N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и N-ацетиллактозамин бяха използвани като акцептори и уридин дифосфат (UDP)-галактоза и цитидин монофосфат (CMP)-N-ацетилневраминова киселина (NANA) като донори за GalT-1 и ST-6, съответно.Ензимните продукти бяха белязани in situ с AA и бяха отделени от субстратите на колона TSKgel Amide 80, използвайки условия на нормална фаза.Ензимните единици бяха определени от пиковите площи чрез сравнение със съпътстващите дериватизирани стандарти Gal-β1-4GlcNAc и NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Бяха установени линейност (време и ензимна концентрация), прецизност (интра- и интеранализ) и възпроизводимост на анализите.Установено е, че анализите са полезни при наблюдение на ензимните активности по време на изолиране и пречистване.Анализите бяха силно чувствителни и изпълнени равни или по-добри от традиционните измервания на базата на радиоактивна захар.Форматът на анализа може да се използва и за измерване на активността на други трансферази, при условие че въглехидратните акцептори съдържат редуциращ край за маркиране.Беше разработен анализ за гликопротеинови акцептори с помощта на IgG.Беше разработен кратък метод за HPLC профилиране за разделянето на IgG гликани (биантенари G0, G1, G2, моно- и дисиалирани), което улесни определянето на GalT-1 и ST-6 активностите по бърз начин.Освен това, този метод на профилиране трябва да се окаже полезен за наблюдение на промените в IgG гликаните в клинични условия.