Продукти

Разбирането на метаболизма на микробния гостоприемник е от съществено значение за разработването и оптимизирането на биокаталитични процеси, базирани на цялата клетка, тъй като диктува ефективността на производството.Това е особено вярно за редокс биокатализа, където се използват метаболитно активни клетки поради регенеративния капацитет на кофактора/косубстрата, ендогенен в гостоприемника.Рекомбинантна Escherichia coli беше използвана за свръхпроизводство на пролин-4-хидроксилаза (P4H), диоксигеназа, катализираща хидроксилирането на свободен L-пролин в транс-4-хидрокси-L-пролин с a-кетоглутарат (a-KG) като косубстрат.В този целоклетъчен биокатализатор централният въглероден метаболизъм осигурява необходимия косубстрат a-KG, свързвайки биокаталитичната ефективност на P4H директно с въглеродния метаболизъм и метаболитната активност.Чрез прилагане както на експериментални, така и на изчислителни биологични инструменти, като метаболитно инженерство и (13)C-метаболитен анализ на потока ((13)C-MFA), ние изследвахме и описахме количествено физиологичния, метаболитен и биоенергиен отговор на биокатализатор на цялата клетка към целевата биоконверсия и идентифицира възможни метаболитни затруднения за по-нататъшно рационално инженерство на пътя. Щам E. coli с дефицит на пролин е конструиран чрез изтриване на гена putA, кодиращ пролин дехидрогеназа.Биотрансформациите на цели клетки с този мутантен щам водят не само до количествено хидроксилиране на пролин, но и до удвояване на специфичната скорост на образуване на транс-4-L-хидроксипролин (hyp), в сравнение с дивия тип.Анализът на въглеродния поток през централния метаболизъм на мутантния щам разкрива, че повишеното търсене на a-KG за P4H активност не повишава потока, генериращ a-KG, което показва строго регулирана операция на TCA цикъл при изследваните условия.В дивия тип щам синтезът на P4H и катализата причиняват намаляване на добива на биомаса.Интересното е, че щамът ΔputA допълнително компенсира свързаната загуба на ATP и NADH чрез намаляване на поддържащите енергийни нужди при сравнително ниски нива на усвояване на глюкоза, вместо да повишава активността на TCA. Установено е, че нокаутът на putA в рекомбинантен E. coli BL21(DE3)(pLysS) са обещаващи за продуктивна P4H катализа не само по отношение на добива на биотрансформация, но и по отношение на скоростите за биотрансформация и усвояване на пролин и добива на hyp от енергийния източник.Резултатите показват, че при нокаут на putA, свързването на TCA-цикъла с хидроксилирането на пролин чрез косубстрата a-KG се превръща в ключов ограничаващ фактор и цел за допълнително подобряване на ефективността на зависими от a-KG биотрансформации.